博落回Macleayacordata(Willd)R.Br.為罌粟科博落回屬植物。博落回含有多種異喹啉類生物堿,包括原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿等活性成分[1]。博落回始載于《本草拾遺》,別號有號筒草、山大筒等,為多年生草本,在我國分布于安徽、江蘇、湖北、湖南、四川等省區(qū)。博落回具有消腫、解毒、殺蟲的功能,用于疔毒膿腫,惡瘡潰瘍,燙傷,頑癬等。現(xiàn)代藥理研究表明博落回具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲殺蛆、止咳平喘、鎮(zhèn)痛、改善肝功能、增強機體免疫力等作用[2]。已有文獻報道采用HPLC法測定博落回果實中血根堿和白屈菜紅堿的含量[3]。本實驗采用HPLC法同時測定博落回不同部位原阿片堿、別隱品堿的含量,為擴大以獲得原阿片堿、別隱品堿為目的的博落回的中藥材市場提供參考。
1實驗材料
1.1儀器
SHIMADZU20A高效液相色譜儀,LC-solution工作站;TP300超聲清洗儀(昆明市超聲儀器有限公司)。
1.2試藥
原阿片堿(中國藥品生物制品鑒定所,批號110853-200402);別隱品堿(SIGMA,批號S450987)。乙腈為色譜純,其他試劑為分析純。博落回樣品采自湖南美可達生物資源有限公司種植園。
2方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱為Luna-C18柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相:0.1%磷酸加三乙胺緩沖溶液(pH3.5)-乙腈(78∶22);流速:0.8mL/min;柱溫:25℃;進樣量:5μL;檢測波長:284nm。
2.2對照品溶液的制備
精密稱取原阿片堿對照品5.24mg,別隱品堿對照品8.62mg,置于同一50mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.3供試品溶液的制備
取干燥的博落回不同部位樣品1.00g,置于200mL圓底燒瓶中,加1%HCl水溶液-甲醇(1:1)200mL,稱定質量,超聲1h,放冷,再稱定質量,用1%HCl水溶液-甲醇(1∶1)補足損失的質量,搖勻,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.4線性范圍考察
精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL,分別置于10mL量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密量取5μL進行分析。以對照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程。原阿片堿:Y=13790X-40090,r=0.9994,線性范圍:4.2~52μg/mL;別隱品堿:Y=8306X-2800,r=0.9999,線性范圍:6.9~86μg/mL。結果表明,原阿片堿、別隱品堿濃度與峰面積線性關系良好。
2.5精密度試驗
取同一對照品溶液,重復進樣6次,測定原阿片堿、別隱品堿峰面積,結果原阿片堿、別隱品堿峰面積的RSD分別為0.2%、0.3%。
2.6穩(wěn)定性試驗
取供試品溶液,自溶液配制后分別在0、2、4、8、12、24h各進10μL,測得原阿片堿、別隱品堿峰面積的RSD分別為0.9%、0.6%。結果表明該樣品溶液在24h內穩(wěn)定。
2.7重復性試驗
取同一部位博落回藥材(葉片,采集時間為2009年8月)粉末,按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液,進樣測定原阿片堿、別隱品堿的含量平均值為1.04%、0.68%,RSD分別為0.9%、0.6%。2.8加樣回收率試驗
精密稱取6份原阿片堿含量為1.04%、別隱品堿含量為0.68%的博落回葉片樣品各0.5g,分別精密加入原阿片堿、別隱品堿對照品5.00mg和3.50mg。按“2.3”項下方法操作,在上述色譜條件下進行測定,計算原阿片堿回收率為99.2%,RSD為1.8%;別隱品堿回收率為99.4%,RSD為0.9%。
2.9樣品測定
對不同部位的博落回樣品按“2.3”項下制成供試品溶液,進行HPLC測定,記錄原阿片堿、別隱品堿峰面積,按標準曲線法計算2個生物堿含量,每組重復測3次】。
通過對原阿片堿、別隱品堿對照品溶液在200~800nm波長掃描,結果顯示原阿片堿、別隱品堿在284、288nm波長處有最大吸收,然后進一步分析比較這2個波長下的圖譜,發(fā)現(xiàn)檢測波長為284nm時,原阿片堿和別隱品堿都有較大吸收,且基線較為平穩(wěn),所以選擇284nm為檢測波長。
通過對比多種流動相,如甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸加三乙胺緩沖溶液、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸加三乙胺緩沖溶液(pH3.5)流動相。結果表明,用乙腈-0.1%磷酸加三乙胺緩沖溶液(pH3.5)做流動相,基線穩(wěn)定,分離度好,峰形對稱,確定用乙腈-0.1%磷酸加三乙胺緩沖溶液(pH3.5)為流動相。本實驗建立了同時測定博落回不同部位中原阿片堿、別隱品堿的定量檢測方法,該方法簡便、準確、靈敏度高。結果表明,博落回不同部位原阿片堿、別隱品堿含量有差異;其中博落回葉片中原阿片堿含量最高,根中別隱品堿含量最高,兩種生物堿之和在博落回不同部位中含量為:根>果實>葉>莖。