在做新藥研發(fā)時(shí)，沒有對(duì)應(yīng)的中藥標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要自制了標(biāo)準(zhǔn)品，可是關(guān)于標(biāo)化的問題一直弄不太明白。一直認(rèn)為應(yīng)該是我用各種能用到的方法來測(cè)定它的含量，然后取一下平均值就可以了。原本是打算用非水滴定，HPLC(UV檢測(cè)器)，HPLC(蒸發(fā)光檢測(cè)器)三種方法來確定一下含量的。可是昨天碰到了一個(gè)前輩，他說這么做是錯(cuò)誤的，應(yīng)該用HPLC的幾種檢測(cè)器都來做一下，然后從中選出結(jié)果最好的那個(gè)，比如說是UV檢測(cè)器，然后用同一個(gè)流動(dòng)相，同一根柱子，一個(gè)波長，分別在三臺(tái)不同廠家生產(chǎn)的HPLC儀上測(cè)定，再取其平均值才是標(biāo)準(zhǔn)品的含量。有這種說法嗎?
個(gè)人覺得那我還不如用兩個(gè)不同的流動(dòng)相在同一臺(tái)機(jī)器上測(cè)定，然后取其平均值呢?
兩個(gè)方法我覺得都不妥，你用HPLC測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的含量，那么用什么做對(duì)照呢?這是外標(biāo)法的問題;如果你用內(nèi)標(biāo)法，那么內(nèi)標(biāo)怎么選?是不是合適呢?專家也會(huì)提出這樣的問題;那么你會(huì)說用歸一化法，可是這個(gè)方法本來就存在著條件摸索的問題，你采用的液相條件能確定把所有的雜質(zhì)給分離嗎?所以現(xiàn)在化藥一般決不會(huì)用歸一化法來測(cè)含量的。
所以推薦采用非水滴定法，只要你確定標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度正確，滴定方法得當(dāng)，專家不會(huì)提出太大問題。我們以前沒有標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)都會(huì)用滴定法確定標(biāo)準(zhǔn)品的含量，全部都通過?！ ?/span>
我想原因應(yīng)該是使用HPLC(UV檢測(cè)器)，對(duì)一個(gè)新藥建立含量測(cè)定方法，本身這個(gè)條件就是在不斷的摸索過程中建立起來的。你不能說你建立的這個(gè)方法是最好的，只不過是這個(gè)方法滿足了各方面的要求，這個(gè)方法你可以使用而已?？隙☉?yīng)該還存在著和你這個(gè)條件更好或者是差不多一樣的條件。就拿我這個(gè)藥來說吧，我就找到了兩個(gè)都不錯(cuò)的條件，緩沖鹽不一樣，PH值也不一樣，但效果都不錯(cuò)，后來我就選了理論塔板數(shù)稍高一點(diǎn)的那個(gè)條件。
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)化，用HPLC的話只能用面積歸一化法了，我個(gè)人覺得用不同的條件出的峰肯定會(huì)略有差別的，我用兩個(gè)不同的條件分別來測(cè)定，這樣可以增大可靠性。這就有點(diǎn)像從中草藥中提取分離單體化合物一樣(不知道你在中草藥提取分離方面怎么樣?)，一般在分離中草藥中的單體化合物時(shí)，當(dāng)你懷疑用一個(gè)展開劑跑出來的點(diǎn)是個(gè)單體的話，一般你還需要換1-2種完全不同的展開劑進(jìn)行展開，或者要把硅膠換成聚酰胺或葡聚糖凝膠什么的。如果在變換了各種條件仍然是一個(gè)點(diǎn)，那基本就可以確定是個(gè)單體化合物了，然后再去打譜確定結(jié)構(gòu)。
對(duì)非水滴定法的說法比較贊成。首先要確定你的標(biāo)準(zhǔn)品的含量，至少應(yīng)該做正相，反相，DAD檢測(cè)。至于不同儀器，不同實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)試是另外一回事?！ ∫话銇碇v，用HPLC法來測(cè)定含量，是需要有對(duì)照品的，不管外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法都需要。而你做的是一類新藥，肯定沒有對(duì)照品。所以，我同意 cyl003135 的說法，需要有一個(gè)方法，作方法學(xué)研究。但肯定不能是HPLC法?？梢杂梅撬味ǚ?，用電位指示終點(diǎn)。作出滴定曲線。如果有合適的指示劑，可以比較一下，如果滴定終點(diǎn)電位與指示劑變色終點(diǎn)能夠統(tǒng)一，也可用指示劑指示終點(diǎn)。但仍要做線性、精密度、穩(wěn)定性、回收率等資料。必要時(shí)，需要作影響因素、加速、長期試驗(yàn)考察對(duì)照品的穩(wěn)定性。
今天就我的這個(gè)問題去咨詢了我們省藥檢所化藥室的主任,她是這樣回答的：
1、要用兩個(gè)不同的方法來標(biāo)化。比如說我這個(gè)原料藥就可以采用非水滴定(容量分析法)和HPLC法(儀器分析法)。2、HPLC法必須采用兩個(gè)完全不同的條件來分別測(cè)定，用面積歸一化法來計(jì)算就可以了。
所謂不同的條件包括：
?、磐耆煌牧鲃?dòng)相(比如說我這個(gè)項(xiàng)目，目前我已經(jīng)摸索到了兩個(gè)不同的條件，雖然都是用的乙睛-水系統(tǒng)，但緩沖鹽和PH值分別都是不同的，所以就可以使用這兩個(gè)條件了。)
?、撇煌放频纳V柱(就是換根柱子，至于國產(chǎn)還是進(jìn)口的倒是無所謂)
?、遣煌放频腍PLC色譜儀(如果條件實(shí)在不允許，在同一臺(tái)儀器上用不同的流動(dòng)相和不同的色譜柱進(jìn)行測(cè)定也可以)
3、取三個(gè)方法含量的平均值就可以了。(我現(xiàn)在已經(jīng)用非水和一種HPLC條件測(cè)定過了，基本含量差距不大，如果差距很大，那就取含量低的那個(gè)方法的平均值)
4、HPLC法測(cè)定含量還是用UV檢測(cè)器為佳，不需要使用其他檢測(cè)器測(cè)定。
5、在藥品的研制過程中(包括新藥的臨床前申報(bào))，作為研究單位，只要你用確實(shí)可靠的方法確定了你的標(biāo)準(zhǔn)品的含量就可以了。等到藥品被批準(zhǔn)上市的話，你提供標(biāo)準(zhǔn)品中檢所會(huì)測(cè)定含量的。最后的含量還是由中檢所確定的?；旧舷裆狭蟹椒y(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的含量是可以滿足申報(bào)新藥的要求的。
也許是我接觸的新藥研發(fā)比較少，完美的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定在新藥研究中(比較嚴(yán)格的研究所我就不了解了)是很少那樣做的，基本就是像上面說的那個(gè)化藥室的主任所說的，大家一般都是只要你法定機(jī)構(gòu)說了這樣做可以那就決不愿意多做工作的，呵呵，反正我是這個(gè)樣子。最后法定標(biāo)準(zhǔn)品的含量是要由中檢所給出的，不是你申報(bào)單位說了算。我想您說的化藥一般絕不會(huì)用歸一化法來測(cè)含量可能意思是指的一般質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定，那是不能用歸一法。但標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定和含量測(cè)定應(yīng)該是兩個(gè)不同的概念。我以前做植化分離得到的單體給純度時(shí)，也一般就是只用歸一法，只是用不同的色譜條件、不同色譜柱等。
化藥標(biāo)準(zhǔn)品的含量測(cè)定首選還是化學(xué)法，根據(jù)化藥本身的性質(zhì)選方法，是非水滴定、酸堿滴定、電位滴定還是其他。你雖然做的是一類藥，但基本的大類你自己應(yīng)該比較清楚的，參考同類產(chǎn)品的原料含量測(cè)定的方法進(jìn)行方法學(xué)的摸索，只要你化學(xué)物的性質(zhì)分析清楚了，應(yīng)該不是什么問題。
原料含量測(cè)定是化學(xué)法?，F(xiàn)在大家儀器用慣了，總喜歡一開始就用HPLC法。其實(shí)大家看看新藥研究指南中的內(nèi)容，原料藥首選是化學(xué)法的。只有在化學(xué)法不能的情況下才用HPLC。要用HPLC就要用到標(biāo)準(zhǔn)品。你本來就是要做化藥標(biāo)準(zhǔn)品的含量測(cè)定，當(dāng)然是要用化學(xué)法。
藥檢所的答案也是很官方的。因?yàn)槟阋苍S也能通過。但是為什么不去自己找一個(gè)好的化學(xué)法去做含量測(cè)定的方法呢。制劑才首選液相方法。你可以用化學(xué)法測(cè)定自己提純好的原料藥做標(biāo)準(zhǔn)品。
標(biāo)化應(yīng)該不是測(cè)定含量的問題，測(cè)定含量的前提就是有對(duì)照品，沒有對(duì)照品的情況下如何保證測(cè)定的準(zhǔn)確性?如何進(jìn)行方法評(píng)價(jià)?
標(biāo)化的過程應(yīng)該是雜質(zhì)測(cè)定的過程，主要包括(1)HPLC色譜雜質(zhì)，(2)水分，(3)無機(jī)鹽，(4)殘留溶劑;除去所有雜質(zhì)的量即可得到對(duì)照品的純度。前面提到的方法在國內(nèi)盡管可用，但不能稱其為標(biāo)化。
一個(gè)新藥在制定標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候，往往已經(jīng)有了該新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。那么，該標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)首先按照該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做一下全面的質(zhì)量檢查(用到對(duì)照品的項(xiàng)目除外);如果該對(duì)照品的精制過程不同于藥物的精制工藝，則應(yīng)針對(duì)該精制過程做相應(yīng)的化學(xué)檢查。一般的化學(xué)雜質(zhì)應(yīng)很低。
使用HPLC做純度分析是必須的，如果不適用，則至少應(yīng)借助TLC分析其純度。均應(yīng)選取完全不同的流動(dòng)相，證明其雜質(zhì)是被分開的。HPLC應(yīng)用二極管檢測(cè)器測(cè)定主峰的純度，若懷疑有UV不能檢測(cè)的雜質(zhì)，則應(yīng)再選用其他檢測(cè)器測(cè)試一下。
如果純度很高，則可以采用面積歸一化法定量。如果有較大雜質(zhì)，應(yīng)確定較大雜質(zhì)的性質(zhì)及相對(duì)響應(yīng)因子，也可以通過確定最大雜質(zhì)的量來確定主含量。測(cè)定的結(jié)果應(yīng)當(dāng)與另外一種方法如化學(xué)法比對(duì)，以驗(yàn)證其正確性。
首先要明白什么叫標(biāo)化。利用基準(zhǔn)物質(zhì)(或用已知準(zhǔn)確濃度的溶液)來確定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的操作過程，稱為“標(biāo)定”或稱“標(biāo)化”。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)化雖然沒有嚴(yán)格的定義，但其基本意義應(yīng)該是一致的，如果不知道一個(gè)已知含量如何確定未知含量。
使用UV檢測(cè)器可以看做是將分離開(是否真正分離開恐怕DAD的峰純度檢測(cè)也無法說明)的物質(zhì)使用分光光度法測(cè)定其吸收度，在沒有確定含量的基準(zhǔn)物時(shí)很難得知被標(biāo)定物的含量。至于歸一化法，如果不是使用通用型檢測(cè)器(蒸發(fā)光，MS)光靠一個(gè)UV(包括DAD)首先很難選定測(cè)定波長，如果人為因素參預(yù)其中，那就不是一個(gè)誤差可以形容的了;其次流動(dòng)相的選擇，比如甲醇：水，和甲醇：水(緩沖鹽)，在這里加入緩沖鹽其造成流動(dòng)相洗脫能力差異有多大，是否如 TLC 中使用三種不同極性的展開劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)敲从姓f服力。
選用三種方法測(cè)定后取其平均值，其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義何在。三種方法的誤差來源不同，用三個(gè)方法分別測(cè)定6次，再取其平均值，是否還需要考察方法的耐用性，不同的人不同天里用不同的方法測(cè)定后進(jìn)行t檢驗(yàn)，總之想起來頭都痛了。
個(gè)人認(rèn)為首先選取一種化學(xué)分析法測(cè)定其含量，再用HPLC偶聯(lián)通用型檢測(cè)器歸一化法測(cè)定，或者采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量(內(nèi)標(biāo)不好選，但也不是不能選)，對(duì)這幾組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，判定其是否有差異，也許是一個(gè)辦法。
根據(jù)本人經(jīng)驗(yàn)，建議可以在工作的基礎(chǔ)上嘗試NMR定量法。最常用的HPLC法終歸只是面積歸一化，是相對(duì)含量，對(duì)于沒有紫外吸收的雜質(zhì)難以檢測(cè)。而 NMR可以做到絕對(duì)定量，有多少定量質(zhì)子信號(hào)就對(duì)應(yīng)相應(yīng)的純物質(zhì)量。我做過此方面的研究，比較可行，但需根據(jù)你化合物的結(jié)構(gòu)選擇合適的定量?jī)?nèi)標(biāo)和溶劑、適宜的樣品濃度、適宜的一組或幾組定量質(zhì)子、多次采樣、多次積分、優(yōu)化馳豫時(shí)間等，只是需要做方法學(xué)的考察。
